Tykktarmskreft og patologi

Kirurgens ansvar

Preparatet bør være klippet opp frem til, men ikke gjennom, tumorområdet og vaskes godt før det legges i en fikseringsvæske (1). Deretter sendes det til patologisk avdeling, og en informativ remisse bør foreligge. Kirurgens beskrivelse av det native preparatet er viktig ettersom fiksering kan medføre skrumpning og vridning av preparatet som kan gjøre det vanskelig å gi en god beskrivelse i ettertid. Det synes ikke nødvendig å spenne opp preparatene slik som det noen ganger gjøres med polypper som undersøkes med tanke på vurdering av reseksjonsrender.

Patologirapport

Det er laget retningslinjer for histopatologiske besvarelser av kreftprøver i mange land, og besvarelsene synes å bli mest komplette når man benytter sjekklister eller maler (2-5). Den Norske Patologforening har utarbeidet retningslinjer for slike besvarelser (6), og har sammen med NGICG/Kolorektalcancerregisteret laget en standardisert elektronisk mal for tarmkreft (CRC). En studie viste at patologiavdelinger som benyttet sistnevnte mal hadde en signifikant økning i besvarelsen av 11 hovedpunkter (7). Det er imidlertid et fåtall av landets patologiavdelinger som benytter seg av denne, mest på grunn av vanskeligheter med å implementere den i patologisystemene lokalt. Flere av avdelingene har imidlertid gode lokale maler som brukes og som fungerer godt. Arbeidet med oppdatering og tilrettelegging av elektroniske maler pågår stadig (8), uten at man har noen tidsplan for dette. I Nasjonalt handlingsprogram finnes også forslag til mal for besvarelse (9). Noe av årsaken til variasjon av besvarelse er basert på tradisjon ved den enkelte patologiavdeling, men manglende bruk av den standardiserte elektroniske malen er også basert på økonomiske forhold ettersom man må betale for å få lagt disse inn i patologisystemene. 

TNM-klassifikasjonen

«International Union against cancer» (UICC) har utarbeidet en TNM-klassifikasjon som baserer seg på dybdevekst av primærtumor (T), om det er metastaser i regionale lymfeknuter (N) og om det er fjernmetastaser (M). I tillegg finner man en del deskriptive symboler hvor for eksempel p viser at klassifikasjonen er basert på patologisk vurdering. De fleste bruker 7. utgave som er den nyeste og kom ut i 2009 (10). På bakgrunn av TNM-klassifiseringen foretas en stadieinndeling, og sykdomsstadium er den sterkeste prognostiske faktor ved CRC. Endringen fra 6. til 7. utgave gikk mest på klassifisering av lymfeknuter (LK), men det ble også foretatt mindre endringer i tumor-klassifiseringen. Isolerte tumorøyer (deposits) har kommet inn i klassifiseringen (N1c) og defineres som tumorøyer i subserosa eller mesokolon uten sikker lymfeknuteopprinnelse (ujevne eller infiltrative ytre begrensninger). Disse kan representere diskontinuerlig spredning, venøs invasjon eller en totalt reorganisert lymfeknute (Tabell 1).

Lymfeknuter

Deteksjon av lymfeknuter er viktige med tanke på spredning og målet er funn av minst 12 lymfeknuter fra hvert resektat. Dette er i henhold til WHO sine anbefalinger for å kunne gi korrekt TNM-klassifisering (11). Det kan være vanskelig å finne tilstrekkelig med lymfeknuter, og man har derfor prøvd ut flere metoder for å gjøre det lettere. En fikseringsvæske bestående av konsentrert eddiksyre, etanol, destillert vann og formaldehyd (GEWF) gir bedre fremstilling av lymfeknuter da disse blir hvite i forhold til det omliggende mer gulige fettvevet (12). Studier har vist at denne fikseringsmetoden øker antall undersøkte lymfeknuter (13), og noen sykehus i Norge har innført metoden. Andre har vist samme gevinst dersom man injiserer metylen-blått intra-arterielt i ferskt preparat (14).

Flere faktorer er avgjørende for antall lymfeknuter i et resektat, blant annet kvaliteten på kirurgens disseksjon (komplett mesokolisk eksisjon), lengden på preparatet og anatomisk lokalisasjon med sannsynlighet for å finne flest lymfeknuter ved høyresidig cancer (15, 16). Dersom det er funnet færre enn 12 lymfeknuter, bør det føre til regranskning av preparatet for å finne flere. Dersom færre enn 9 lymfeknuter er undersøkt hos pasient uten lymfeknute metastaser (TNM stadium II / Dukes’ B), skal pasienten tilbys adjuvant kjemoterapi, siden det er en reell risiko for at sykdomsstadiet er underklassifisert og flere studier viser dårligere prognose hos denne pasientgruppen. 

Reseksjonskanter

I Kolorektalcancerregisteret registreres avstand til nærmeste og fjerneste ende-reseksjonsrand i millimeter, mens avstand til cirkumferente reseksjonsrand (crm) ikke registreres. Ved noen patologilaboratorier er crm likevel tatt med i patologi-malen for kolon, på samme måte som det registreres ved rektumcancer.

Kvaliteten av kirurgens disseksjon kan vurderes makroskopisk på uttatt preparat. Dette har vært gjort i flere studier av rektumcancer, og man klassifiserer da som komplett, delvis komplett og ikke komplett mesorektal eksisjon. Tilsvarende er foreslått brukt også ved koloncancer (17). En annen gradering er foreslått: «Dårlig» – disseksjon inn i mesokolon med reseksjonskant inn til muscularis propria (mp). «Moderat» – med disseksjon inn i mesokolon, men ikke helt inn til mp.  «God» – intakt mesokolon med glatt peritonealkledt overflate. I det siste tilfellet vil den kirurgiske (cirkumferente) reseksjonskant være den ikke-peritonealkledte kanten. Det er lettere å dissekere med intakt mesokolon på venstre side enn på høyre side, og vanskeligst i tverrkolon og fleksurer (17). For pasienter med stadium III-sykdom har man vist at god kvalitet på cirkumferensiell disseksjon er assosiert med lengre overlevelse (17).  

Tykktarmskreft som er fjernet med intakt mesokolon og fjernelse av alle regionale lymfeknuter omtales som komplett mesokolisk eksisjon (CME) (18). Vurdering av kvalitet på mesokolisk disseksjon og avstand til cirkumferente reseksjonskant bør vurderes innført som rutine ved coloncancer.

Andre histopatologiske faktorer

Grad av differensiering rapporteres stort sett alltid, men noen varianter bør nevnes spesielt. Differensiering av adenokarsinomer gjøres generelt på bakgrunn av grad av bevarte kjertelformasjoner (19). Ved medullære karsinomer har tumorvevet er lite differensiert preg, men med rikelig infiltrasjon av lymfocytter. Denne type karsinomer er sjeldne, med en beregnet insidens på om lag 3,5 tilfeller per 10 millioner mennesker (5-8 pr 10 000 koloncancere), og de synes å ha en gunstigere prognose enn den mer vanlige, lite differensierte varianten (20, 21). Koloncancer med mikropapillær komponent (>5 % av tumor totalt) i et adenokarsinom forekommer i om lag 10 % av alle tilfellene, og synes i motsetning til den medullære varianten å være mer aggressiv med høy forekomst av lymfeknutemetastaser (22). 

Rikelig med lymfocyttære infiltrater i forbindelse med tarmkreft er assosiert med generell signifikant økt overlevelse. Typer inflammatorisk aktivitet kan deles inn i Crohn-liknende, peritumoral eller intratumoral og synes også hver for seg å ha en positiv prognostisk verdi (23). Alle er tegn på økt immunrespons (24). Det er ingen systematisk rapportering av økt lymfocyttær infiltrasjon fra patologen, men det beskrives noen ganger i en mikrobeskrivelse.

Perineural infiltrasjon er tumorvev som ligger i tilslutning til nerver, i det perineurale rom. Man finner dette i en del resektater, men det rapporteres sjelden. Det er vist at perineural infiltrasjon kan være en viktig prognostisk faktor og assosiert med høyere forekomst av metastatisk sykdom, residiv og kortere overlevelse (25).

Tumorinvasjon i blod- eller lymfekar er også en prognostisk markør som gir økt risiko for lymfeknuter og fjernmetastaser (26). Man skiller mellom intra- og ekstramural vaskulær invasjon hvor intramural indikerer invasjon i kar i submucosa/mp, mens ekstramural invasjon (EMVI) er innvekst i kar utenfor muscularis propria. EMVI beskrives ikke rutinemessig fra alle patologer, men bør rapporteres siden det er en sterk negativ prognostisk faktor som kan være viktig ved vurdering av tilleggsbehandling.

I tillegg til disse faktorene finnes det en rekke andre histopatologiske faktorer som har vært studert (27). Tumor budding er isolerte enkeltceller/små grupper av kreftceller (< 5 celler) som man kan finne i stroma like foran tumor og sees på som en invasiv hendelse. Dette kan være et uttrykk for aggressiviteten til en tumor og noe om dens kapasitet til å metastasere (28). En ny studie hvor man har undersøkt på tilsvarende små tumorgrupper uten kjertelformasjoner med flere enn 5 celler («poorly differentiated clusters», PDC) har vist at overlevelse er assosiert med antall PDC og dette kan kanskje benyttes som en ny variabel innen gradering av tarmkreft (29). Evnen til å danne nye kar (angiogenese) er også assosiert med aggressiv tumorvekst, og høy tetthet av nydannede små kar predikerer dårligere overlevelse hos pasienter med tarmkreft (30). Ingen av disse faktorene rapporteres i daglig rutine og vurderes mer i forskningssammenheng.

Molekylære markører

Immunhistokjemisk farging er en utbredt metode som benyttes ved alle patologilaboratoriene i Norge. Man benytter en kombinasjon av immunologi og histokjemi for å visualisere spesifikke antistoffer som har bundet seg til spesifikke antigener på snitt av tumorvev. Vurdering av binding av antistoff gjøres i lysmikroskop og er en del av den daglige rutine for patologer. På denne måten kan man i de fleste tilfeller påvise sannsynlig utgangspunkt for cancer med ukjent origo, og påvise forskjellige egenskaper ved tumor, blant annet proliferasjonsindeks. Metoden er generelt robust, rask og relativt rimelig.

Undersøkelse av mutasjoner i arvematerialet kan gjøres indirekte på protein-nivå eller mer direkte på gen-nivå. Dersom mutasjon gir et defekt protein, slik som man ofte kan se ved Lynch syndrom, kan man indirekte påvise genfeilen ved manglende eller endret proteinuttrykk ved hjelp av immunhistokjemi. I mange tilfeller, slik som ved undersøkelse på KRAS, er mutasjonsanalyse ved sekvensering av DNA fra tumorvev nødvendig. Dette kan gjøres ved hjelp av flere forskjellige metoder, men felles er at de er tidkrevende og oftest ganske kostbare. Godt innkjørte metoder er imidlertid oftest svært pålitelige og til god hjelp for videre diagnostikk eller pasientbehandling.

Arvelig tykktarmskreft – Lynch syndrom

Lynch syndrom er en av flere former for arvelig tykk- og endetarmskreft og forekommer hos 2-5 % av de som får CRC. Det skyldes mutasjon i mismatch reparasjonsgener (MMR-gener). Dette kan undersøkes indirekte immunhistokjemisk ved å se etter manglende uttrykk av proteinene som de koder for (i tumorvev). Man kan også undersøke på mikrosatellitt instabilitet (MSI) ved hjelp av molekylærpatologiske metoder hvor man ser etter endringer i baserekkefølgen (instabilitet) i visse områder av DNA. Om lag 15 % av alle CRC har MSI, hvor hovedmekanismene er enten mutasjon i DNA (Lynch syndrom) eller hypermetylering av DNA (sporadisk CRC). Begge resulterer i manglende funksjon av mismatch reparasjonsproteinene. Mange patologiavdelinger utfører disse undersøkelsene. Dersom man finner indikasjon for dette kan DNA sekvenseres for å undersøke direkte på genfeil (kun enkelte laboratorier). I henhold til Nasjonalt handlingsprogram bør svulster fra alle pasienter under 60 år undersøkes på MMR/MSI (9). Dette gjøres automatisk ved noen avdelinger, mens det andre steder gjøres kun etter rekvisisjon fra kliniker eller medisinsk genetiker. Standard-utredning bør være slik det er anbefalt i handlingsprogrammet med automatisk undersøkelse av tumor hos alle pasienter <60 år med immunhistokjemisk undersøkelse med henblikk de 4 vanligste reparasjonsproteinene. Dersom man finner manglende uttrykk kan man gjøre videre undersøkelse med tanke på MSI, og eventuell sekvensering av DNA. Diagnostisering av pasienter med Lynch syndrom er viktig med tanke på oppfølging av familiemedlemmer.

Ved stadium II sykdom er MSI er en positiv prognostisk faktor. MSI er hyppigst i høyresidige svulster og forekommer hos om lag 30 % (31). Foreløpig brukes ikke MSI status rutinemessig for vurdering av prognose og tilpassing av adjuvant behandling. Immunhistokjemiske undersøkelser kan gjøres på små biopsier, men for MSI-undersøkelse er det ofte nødvendig med noe mer materiale som derfor helst gjøres på resektater.   

RAS

Behandling med EGFR antistoff (Cetuximab/Panitumumab) kan være aktuelt som 3. linjes behandling hos pasienter med inoperable metastaser fra CRC. Antistoffet binder seg til EGFR-reseptoren på celleoverflaten og i signaloverføringsveien inn mot cellekjernen er RAS en viktig komponent (Figur 1). Flere gener koder for RAS-proteinet og KRAS er en av disse. Pasienter med KRAS-villtype (uten mutasjon) tumor responderer på behandling med EGFR antistoff, hvilket fører til signifikant bedre overlevelse, mens de med KRAS mutasjon (vanligst i ekson 2) ikke responderer (32). Pasienter med RAS-mutasjon ser faktisk ut til å ha dårligere overlevelse dersom de får antistoff mot EGFR enn de som ikke behandles med dette antistoffet (33). KRAS er derfor en viktig prediktiv biomarkør. Omlag 40 % av pasienter med CRC har KRAS mutasjon, og undersøkelsen på dette gjøres ved flere patologiske avdelinger etter rekvisisjon fra kliniker.

Undersøkelser på genene som koder for RAS gjøres ved hjelp av ulike teknikker. Noen laboratorier har laget egne oppsett hvor aktuelle deler av RAS genene sekvenseres (direkte sekvensering), mens andre bruker kommersielle prober som spesifikt påviser relevante mutasjoner (realtime PCR). Eksoner er den aktive protein-kodende del av genet, og kodonet er en DNA sekvens på 3 baser som er «kodeord» for en bestemt aminosyre. Til nå har man som regel bare testet på mutasjoner i KRAS ekson 2, kodon 12 og 13, men man bør sannsynligvis utvide testingen til ekson 3 og 4 på KRAS. Dersom man har mutasjon i KRAS er det ikke nødvendig å teste for mutasjoner i NRAS ettersom den ene utelukker den andre.  Dersom man ikke
finner mutasjon i KRAS, bør man teste på tilsvarende mutasjoner på NRAS, som finnes hos omlag 10 % av CRC. Det er kapasitetskrevende å skulle undersøke så vidt mange gener i så mange eksoner, og mange laboratorier er ennå ikke helt klare med rutinemessig utvidet KRAS eller NRAS undersøkelser. Behandling med EGFR antistoff kan sannsynligvis være aktuelt for flere enn 3. linje-pasienter og det vil øke behovet for molekylære analyser. Anbefalinger i handlingsprogrammet som skal revideres inneværende år, vil måtte ta hensyn til dette.

BRAF

BRAF mutasjoner forekommer ikke hos pasienter som har RAS-mutasjoner. Det er usikkerhet om frekvensen av slike mutasjoner, men et estimat er 10 % av alle CRC. Disse pasientene har en dårligere prognose enn andre pasienter med CRC (34), og de responderer muligens også dårligere på behandling med EGFR antistoff (33, 35). Derfor er det av interesse å undersøke med henblikk på en tettere oppfølging og mer aggressiv behandling.

Undersøkelse på BRAF gjøres oftest ved hjelp av molekylærpatologiske metoder, men man har nå utviklet et godt antistoff som kan gjenkjenne det proteinet som er dannet på bakgrunn av den mest vanlige mutasjonen i BRAF (36). Dette vil kunne gjøre det raskere og rimeligere å undersøke med tanke på denne mutasjonen. I en overgangsfase vil man måtte validere metodene opp mot hverandre. Ved enkelte laboratorier gjøres undersøkelse på BRAF mutasjoner rutinemessig, men det vanligste er at kliniker rekvirer i hvert enkelt tilfelle.

Konklusjon

Det er viktig med godt samarbeid mellom klinikere og patologer, og kirurgene kan påvirke rapportene fra patologiavdelingene. En standardisert, mal-basert besvarelse gir bedre rapporteringen fra patologen. Sammenlignet med fritekst er den lettere å lese og tolke for klinikeren. Ny viten innen molekylærpatologi vil sannsynligvis føre til at stadig flere molekylærgenetiske undersøkelser inngår i rutinediagnostikken som ledd i en mer personlig tilpasset (neo-) adjuvant og palliativ behandling. Tverrfaglige møter hvor klinikere og patologer møtes er viktig for god kommunikasjon, og gir de beste mulighetene for optimal behandling av den enkelte pasient.