DEOKSYRIBONUKLEINSYRE (DNA)
DNA består av nukleotider med fosfatgrupper, sukkermolekyl og baser. Adenin er i basepar med thymin og guanin med cytidin. Mennesket har ca. 3 milliarder basepar! Tre basepar danner et codon, og hvert codon koder for én aminosyre. Eksonene er den delen av genomet som transkriberes til RNA og utgjør bare 1,1 % av alt arvematerialet.
GENETISKE OG EPIGENETISKE FORANDRINGER
Genetiske forandringene som gir små endringer i DNA er punktmutasjoner, små innskudd (insesjoner) eller frafall (delesjoner), eller en kombinasjon av de to siste, i spesifikke ekson. Mutasjoner i proto-onkogenene RAS og BRAF tilhørerblant de som gir små endringer. Større strukturelle forandringer er inversjoner, delesjoner, duplikasjoner, translokasjoner eller amplifikasjoner.
Epigenetiske forandringer endrer ikke på basesekvensen i DNA, men er kovalente endringer i DNA histoner eller pakking av kromatin. Dette kan gi endringer av genaktiv iteten som kan medføre både økt og slukket transkripsjon av DNA. Metylering av mismatch repair-genet MLH1 er eksempel på en epigenetisk forandring.
BRAF OG RAS
BRAF og RAS koder for proteiner som kontrollerer cellevekst og død. Disse er proto-onkogener og kan være viktige ved behandling av svulster i tykk- og endetarm (1, 2). BRAF og RAS er både prognostiske og prediktive markører og er spesielt aktuelle når pasienten har ikke-kurable metastaser (3). RAS-muterte svulster responderer dårlig på tyrosin kinase-inhibitorer (TKI). Derfor vil det kun være aktuelt å gi pasienter med RAS villtype (uten påviste mutasjoner) behandling med TKI kombinert med kjemoterapi. Pasienter med BRAF-mutasjon har dårligere overlevelse og dårligere progresjonsfri overlevelse sammenliknet med de ikke-muterte. Disse pasientene kan ha effekt av vascular endothelial growth factor-inhibitor (VEGFinhibitor) sammen med kjemoterapi. BRAF har forøvrig diagnostisk verdi siden BRAF-mutasjon i kombinasjon med metylering av MLH1 indikerer sporadisk etiologi (se under).
For å undersøke BRAF og RAS kan man benytte tradisjonell PCR-metodikk hvor man undersøker områder innen spesifikke ekson der man kan forvente relevante genforandringer. De siste årene har mange laboratorier gått til innkjøp av enkle, fullautomatiserte systemer med real time PCR (Idylla™). Et tynt snitt fra svulsten benyttes da for undersøkelse av RAS-mutasjoner, et annet for BRAFmutasjoner.
Man kan også benytte seg av next generation sequencing (NGS) hvor en liten mengde svulstvev undersøkes på forandringer i mange ekson samtidig. Dette er en vevsbesparende og dyptgående undersøkelse av svulstvevet som blant mange regnes som dagens «gullstandard», men som krever et laboratorium med spesialkvalifisert personell og ressurser innen bioinformatikk.
Større strukturelle endringer på kromosomnivå og enkelte translokasjoner egner seg ikke så godt for NGS. Man benytter seg da av tradisjonell PCR eller fluorescerende insitu-hybridisering (FISH) om man har mistanke om at dette foreligger. Dette er vanligvis ikke aktuelt for adenokarsinomer i tykk- og endetarm.
MISMATCH REPAIR (MMR)-PROTEINER OG MIKROSATELITTINSTABILITET (MSI)
MMR-proteiner reparerer feil på DNA i forbindelse med replikasjon, men i enkelte tilfeller dannes ikke funksjonelle proteiner. Dette kan være forårsaket av mutasjoner i genene eller epigenetiske forandringer. Mutasjon i et MMR-gen kan være nedarvet (kimbanemutasjon), som ved Lynch syndrom, eller ha oppstått spontant (somatisk mutasjon). Disse genforandringene kan føre til manglende eller feil avskrivning av et MMR-gen som videre gir tapt av uttrykk av funksjonelt MMR-protein (deficient) og benevnes således dMMR. I dag brukes to metoder for å påvise manglende proteinfunksjon, som begge regnes som indirekte metoder.
For å teste om funksjonelle MMR-proteiner er dannet kan man bruke immunhistokjemiske farginger. Denne metoden har vært benyttet ved patologiske laboratorier i en årrekke. Den regnes som rask, stabil og robust, og er også relativt rimelig. Prinsippet er at forskjellig vev har nokså spesifikke antigener som kan markeres med antistoffer. Dersom antistoffene finner disse antigenene blir de «hengende fast» og kan deretter bli presentert for et sekundært antistoff som farges slik at de kan vurderes i mikroskopet. Manglende antigener gjør at antistoffene ikke bindes til vevet, og ingen spesifikk farging fremstilles. Se figur 1.
FIGUR 1: Spesifikke antigener i celler og vev gjenkjennes av spesifikke, primære antistoffer. Et sekundært antistoff med farge som kan sees i lysmikroskop fester seg til det primære antistoffet.
Mikrosatelitter (én til ti nukleotider) er tandemrepetisjoner som danner repetitive genomiske regioner og som lett kan bli ustabile (eksempel CACACACA eller CCCCCCCC) (4). Disse kan variere fra person til person, men er stabile for alle cellene i et individ (mikrosatelittstabil, MSS). Dersom antall repetisjoner i tumor varierer fra normale celler hos et indvid rapporteres dette som MSI. MSI regnes mest som en «passasjer» som gir svulstvev en signatur og ikke som en viktig mutasjon i selve kreftutviklingen (5). Mikrosatelittinstabilitet (MSI) er en god indikator for at det foreligger dMMR. Pasienter med karsinomer i tykk- og endetarm i tidlig stadium som innehar MSI / dMMR har bedre prognose enn de som ikke har dette, og dette vil ha innvirkning på valg av behandling (6-9). Bakgrunnen for dette antas å være at når dMMR ikke utfører DNA-reparasjon, får man en opphopning av feil ved avskrivning av DNA med videre dannelse av nye proteiner som oppfattes som fremmede (neoantigener). Disse kan stimulere til antitumor respons fra «verten» og gi en bedre prognose. Man har funnet at pasienter med MSI / dMMR har større effekt av immunterapi, spesielt PD-1 og PD-L1 hemmere (10), og dette kan være viktig for pasientene med utbredt sykdom.
Undersøkelsen for MSI er PCR-basert. Man vurderer fem mikrosatelittområder hvor endringer i to eller flere av disse rapporteres som MSI. Tidligere rapporterte man om svulstvevet var MSI-lav eller MSI-høy. Dette har man gått bort fra, og angir nå svulstene som MSS eller MSI. Ved funn av endring av mer enn ett mikrosatelittområde defineres tumor som MSI.
Man finner MSI i omtrent 15 % av alle kreftsvulster i tykkog endetarm (11, 12) hvor de fleste er forbundet med sporadisk sykdom. Disse svulstene viser oftest manglende uttrykk av MMR-proteinet MLH1 forårsaket av metylering som påvirker lesbarheten av DNA. I om lag 3 % av tilfellene skyldes MSI nedarvede mutasjoner i DNA som ved Lynch syndrom (13-16), og man finner ikke metylering ved utvidet undersøkelse. Ved MSI med manglende tegn til metylering må pasienten henvises videre til genetisk veiledning.
Testing på MMR ved hjelp av immunhistokjemi er likestilt med undersøkelse på MSI ettersom det er stor grad av samsvar mellom undersøkelsene (17). Mange benytter derfor immunhistokjemi som første undersøkelsesmetode. Mer enn halvparten av svulstene som har tap av MLH1 forårsaket av metylering har samtidig en spesifikk BRAF-mutasjon (V600E) (18, 19). Det finnes antistoffer som fanger opp denne mutasjonen og er dermed påvisbar ved immunhistokjemisk undersøkelse. Dette gjør at man i mange tilfeller kan bekrefte at det dreier seg om sporadisk sykdom kun ved hjelp av immunhistokjemisk metode. Se figur 2.
FIGUR 2A: Immunhistokjemisk farging for MSH2 viser normal uttrykk av proteinene i kjernene (tynne piler).
FIGUR 2B: Ved manglende uttrykk i tumorvevet finner man kun kjernefaring i omliggende lymfocytter (brede piler).
Figur 3 viser en algoritme for undersøkelse av svulstvev for MMR / MSI. Man kan velge å gjøre kun immunhistokjemi eller man kan kun undersøke for mikrosatelitter uten å bruke immunhistokjemi. Kombinasjon av begge gjøres også. Ved dMMR med tap av MLH1 vil de fleste undersøke på metylering og / eller mutasjon i BRAF med tanke på sporadisk kreft. Dette er i samsvar med internasjonale retningslinjer som også finnes i enkle oversikter («Molecular In My Pocket») (20).
FIGUR 3: Uttrykk av reparasjonsproteiner (MMR) kan undersøkes med immunhistokjemi. Tap av fungerende MMR (dMMR) vil medføre instabilitet i mikrosatelitter og kan undersøkes med molekylærpatologiske metoder. Den nederste heltrukne linjen indikerer PCR-undersøkelse for MSI uten undersøkelse for dMMR.
RIBONUKLEINSYRE (RNA)
Transkriptomet (RNA) er alle de avskrevne genene fra DNA (ekson-områdene). Undersøkelse av RNA er særlig nyttig ved genfusjoner hvor deler av to gener møtes. På et transkriptom kan man presist definere området hvor de to genene har slått seg sammen, og dette er nyttig ved mange sykdommer. FISH og NGS er gode verktøy i denne diagnostikken. Ved kreft i tykk- og endetarm har det i 2,5 % av tilfellene vært påvist fusjoner i gener som BRAF, NTRK3 og RET (21). Undersøkelse på RNA er derfor foreløpig ikke særlig utbredt for denne svulsttypen.
FREMTIDEN
Molekylærpatolgiske undersøkelser er blitt tatt inn i flere handlingsprogrammer for kreft. I tillegg er det økende etterspørsel fra klinikere om «generell kartlegging» av genforandringer i svulstvev der all behandling er prøvd. NGS brukes også stadig hyppigere som et diagnostisk hjelpemiddel der en er i tvil om en diagnose. Fullautomatisert real time PCR etableres på flere og flere sykehus, og antall genområder som undersøkes med NGS blir stadig flere. I fremtiden vil kanskje enkelte svulster fullgenomsekvenseres.
Det foregår også forsking på «liquid biopsies» hvor prinsippet er at man detekterer små konsentrasjoner av sirkulerende tumor-DNA som har blitt frigjort fra svulstvev og kommet over i kroppsvæsker, for eksempel blod. På denne måten kan man kanskje oppdage et residiv på et svært tidlig tidspunkt før symptomer oppstår, eller det foreligger mer tradisjonelle funn. I fremtiden kan man hypotetisk også «screenes» for kreft med denne metoden, men foreløpig gjøres dette kun i forbindelse med forskning.
Presisjonsmedisin er et fagfelt i rask vekst. Metodene gir enormt mye informasjon om pasientens tumor, men også informasjon om eventuelle arvelige sykdommer. Dette vil gi oss nye etiske problemstillinger. I tillegg vil det kreve bedre basiskunnskaper innen tumorbiologi og genetikk både hos klinikere og patologer.
“Ved MSI med manglende tegn til metylering må pasienten henvises videre til genetisk veiledning.”
REFERANSER
1. Vale CL, Tierney JF, Fisher D, Adams RA, Kaplan R, Maughan TS, et al. Does anti-EGFR therapy improve outcome in advanced colorectal cancer? A systematic review and meta-analysis. Cancer Treat Rev. 2012;38(6):618-25.
2. Kopetz S, Grothey A, Yaeger R, Van Cutsem E, Desai J, Yoshino T, et al. Encorafenib, Binimetinib, and Cetuximab in BRAF V600E-Mutated Colorectal Cancer. The New England journal of medicine. 2019;381(17):1632-43.
3. Nasjonalt handlingsprogram med retningslinjer for diagnostikk, behandling og oppfølging av kreft i tykktarm og endetarm. https://www.helsedirektoratet.no/retningslinjer/ kreft-i-tykktarm-og-endetarm-handlingsprogram/IS%202849%20Nasjonalt% 20handlingsprogram%20kreft%20i%20tykktarm%20og%20endetarm.pdf/_/ attachment/inline/4a5fa48e-8d76-4618-98b3-43af5a85b76e:4c4a29f71e7a68ff93a19dd82848f36a49abff81/ IS-2849%20Nasjonalt%20handlingsprogram%20 kreft%20i%20tykktarm%20og%20endetarm.pdf Oslo: Helsedirektoratet; 2019 [
4. Gemayel R, Cho J, Boeynaems S, Verstrepen KJ. Beyond junk-variable tandem repeats as facilitators of rapid evolution of regulatory and coding sequences. Genes (Basel). 2012;3(3):461-80.
5. Boland CR, Goel A. Microsatellite instability in colorectal cancer. Gastroenterology. 2010;138(6):2073-87 e3.
6. Ribic CM, Sargent DJ, Moore MJ, Thibodeau SN, French AJ, Goldberg RM, et al. Tumor microsatellite-instability status as a predictor of benefit from fluorouracil-based adjuvant chemotherapy for colon cancer. The New England journal of medicine. 2003;349(3):247-57.
7. Merok MA, Ahlquist T, Royrvik EC, Tufteland KF, Hektoen M, Sjo OH, et al. Microsatellite instability has a positive prognostic impact on stage II colorectal cancer after complete resection: results from a large, consecutive Norwegian series. Ann Oncol. 2013;24(5):1274-82.
8. Dienstmann R, Salazar R, Tabernero J. Personalizing colon cancer adjuvant therapy: selecting optimal treatments for individual patients. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology. 2015;33(16):1787-96.
9. Aasebo KO, Dragomir A, Sundstrom M, Mezheyeuski A, Edqvist PH, Eide GE, et al. Consequences of a high incidence of microsatellite instability and BRAF-mutated tumors: A population-based cohort of metastatic colorectal cancer patients. Cancer Med. 2019;8(7):3623-35.
10. Zhao P, Li L, Jiang X, Li Q. Mismatch repair deficiency/microsatellite instability- high as a predictor for anti-PD-1/PD-L1 immunotherapy efficacy. J Hematol Oncol. 2019;12(1):54.
11. Ward R, Meagher A, Tomlinson I, O’Connor T, Norrie M, Wu R, et al. Microsatellite instability and the clinicopathological features of sporadic colorectal cancer. Gut. 2001;48(6):821-9.
12. Popat S, Hubner R, Houlston RS. Systematic review of microsatellite instability and colorectal cancer prognosis. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology. 2005;23(3):609-18.
13. Baglietto L, Jenkins MA, Severi G, Giles GG, Bishop DT, Boyle P, et al. Measures of familial aggregation depend on definition of family history: meta-analysis for colorectal cancer. J Clin Epidemiol. 2006;59(2):114-24.
14. Vasen HF, Blanco I, Aktan-Collan K, Gopie JP, Alonso A, Aretz S, et al. Revised guidelines for the clinical management of Lynch syndrome (HNPCC): recommendations by a group of European experts. Gut. 2013;62(6):812-23.
15. Hampel H, Frankel WL, Martin E, Arnold M, Khanduja K, Kuebler P, et al. Screening for the Lynch syndrome (hereditary nonpolyposis colorectal cancer). The New England journal of medicine. 2005;352(18):1851-60.
16. Hampel H, Frankel WL, Martin E, Arnold M, Khanduja K, Kuebler P, et al. Feasibility of screening for Lynch syndrome among patients with colorectal cancer. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology. 2008;26(35):5783-8.
17. Cicek MS, Lindor NM, Gallinger S, Bapat B, Hopper JL, Jenkins MA, et al. Quality assessment and correlation of microsatellite instability and immunohistochemical markers among population- and clinic-based colorectal tumors results from the Colon Cancer Family Registry. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 2011;13(3):271-81.
18. Deng G, Peng E, Gum J, Terdiman J, Sleisenger M, Kim YS. Methylation of hMLH1 promoter correlates with the gene silencing with a region-specific manner in colorectal cancer. British journal of cancer. 2002;86(4):574-9.
19. Kim YH, Kakar S, Cun L, Deng G, Kim YS. Distinct CpG island methylation profiles and BRAF mutation status in serrated and adenomatous colorectal polyps. International journal of cancer Journal international du cancer. 2008;123(11):2587-93.
20. Committee AfMPTaE. Molecular In My Pocket. https://www.amp.org/AMP/assets/ File/education/MIMP/Oncology_CRC_10_7_19.pdf?pass=17 2019 [
21. Kloosterman WP, Coebergh van den Braak RRJ, Pieterse M, van Roosmalen MJ, Sieuwerts AM, Stangl C, et al. A Systematic Analysis of Oncogenic Gene Fusions in Primary Colon Cancer. Cancer research. 2017;77(14):3814-22.
