Klassiske biomarkører vs. nye molekylær-biologiske tester i prognose og prediksjon ved adjuvant behandling av brystkreft

1. Introduksjon

Moderne behandling av brystkreft er tverrfaglig og multimodal. Kirurgi, strålebehandling og systemisk onkologisk terapi viderefører det additive behandlingsprinsipp fra Hippokrates [1]. Selv om operativ fjerning av primærtumor fremdeles er viktigst i primærbehandlingen av sykdommen er det takket være systematisk deteksjon og målrettet systemisk behandling at utsiktene for brystkreftpasienter er bedret de siste 20 år (Figur 1) [2]. For pasienter i Stadium I er fem-års overlevelse nå 95% og samlet nær 90% for alle stadier. Imidlertid er ikke 5-års perspektiv dekkende ved prognostisering av brystkreft da overlevelseskurvene ikke flater ut selv etter flere ti -års oppfølging. Dette illustrerer det tumorbiologiske fenomenet med seine residiver ved denne sykdommen [3]. Systemisk sykdom kan ikke helbredes, selv om lesjonene er små og asymptomatiske ved deteksjonstidspunktet. Derfor dør det årlig i underkant av 700 kvinner i Norge av brystkreft [2]. Den er en heterogen sykdom med undertyper som har ulik molekylær profil, biologisk fenotype og risiko. Klinikeren utfordres derfor i valg av hvem som skal ha tilleggsbehandling og hvilken terapi som er best for den enkelte pasient. I disse valgene er prognostiske og prediktive faktorer viktige instrument til å styre tilgjengelig behandling (Figur 2) [4]. Nye genekspresjonsanalyser av kreftcellene gir tilsynelatende original prognostisk og prediktiv informasjon [5], men i hvor stor grad gir metodene ny kunnskap og hvor mye overlapping er det med de gamle prognostiske og prediktive faktorene?

2. De klassiske prognostiske og prediktive faktorer

Kjennetegnet på en prognostisk faktor er at den er tilgjengelig ved tidspunktet for kirurgi, den korrelerer med det naturlige forløpet av sykdommen og kartlegges i et materiale hvor pasientene ikke har mottatt aktiv behandling [6]. Følgelig korrelerer den med sykdomsfri- eller total overlevelse i hver subgruppe en slik faktor definerer (Figur 3A). En ren prognostisk faktor gir også samme behandlingseffekt i hver prognostiske undergruppe (Figur 3B). Det finnes i dag over hundre prognostiske biomarkører i brystkreft, men bare en liten håndfull brukes i klinisk praksis. Prediktive faktorer gir informasjon om en gitt behandling har effekt hos de pasientene hvor denne er uttrykt eller mangler. Slike faktorer gir ofte prognostisk informasjon i tillegg (Figur 3C). Testing av prediktive faktorer krever biologiske hypoteser ellers kan feil pasientgruppe bli gitt aktiv terapi og føre til både over- og underbehandling i studiepopulasjonen[4]. Tabell 1 gir en oversikt over de prognostiske og prediktive faktorer som i dag brukes i beslutningsalgoritmen for NBCGs terapianbefalinger i adjuvant behandling av brystkreft [7]. 

  

2.1. Alder

Alder er en viktig klinisk parameter i NBCGs behandlingsalgoritme av flere grunner. Høyere alder øker grad av hormonfølsomhet i svulstene og reduserer effekten av kjemoterapi. Endokrin behandling er derfor en viktigere del av den adjuvante behandlingen ved økende alder. På den annen side finnes det subgrupper av eldre kvinner med aggressiv brystkreftsykdom slik at underbehandling forekommer også i denne aldersgruppen. 

Ung alder er korrelert med lavere østrogen- og progesteronreseptor uttrykk i svulstene. Videre finnes oftere HER-2 og EGFR (=HER-1) positive svulster, større grad av lymfeknute positivsykdom og lavere differensierte tumorer hos unge sammenlignet med eldre kvinner. Dette kan forklare noe av den mer aggressive klinikk vi ser hos yngre brystkreftpasienter. Imidlertid kan en ikke forklare hele det prognostiske bildet med korrelasjoner til disse kjente biomarkører. Når en korrigerer for alle andre faktorer [8]er for øvrig alder også en sterk uavhengig prognostisk faktor for pasienter < 35 år. Genekspresjonsanalyser viser at 367 biologiske relevante gener bare er oppregulert i unge pasienter, og kan tyde på at brystkreft hos yngre er en egen sykdom [9]. 

2.2 Tumorstørrelse 

Tumorstørrelse målt i preparatet etter kirurgi (pT ) korrelerer med både lymfeknutestatus (lymfeknute negative vs. positive) og med antallet metastatiske lymfeknuter. Tumorstørrelsen er også en uavhengig prognostisk faktor som predikerer risiko for fjernmetastaser både på kort og på lang sikt. Det er et lineært forhold mellom pT og risiko for fjernmetstaser [10]. Heterogenitet i tumor øker med størrelsen slik at man kan tenke seg utvikling av mer terapiresistente cellekloner med større metastatisk potensiale når tumor blir stor. I ett materiale fant man tjue års sykdomsfrihet på 88% for svulster < 10mm, 72% for de mellom 11-30mm og 59% for svulster med diameter mellom 31 og 50mm [3]. Median tid til progresjon minket også med økende tumorstørrelse. For lymfeknute negative pasienter er pT spesielt viktig da den alene kan utløse anbefaling om systemisk adjuvant behandling når andre faktorer holdes uendret[7]. Dette gjenspeiles også i risikostratifiseringen etter St. Gallen kriteriene der man ser at for å tilhøre lav-risiko gruppen må tumor være <2 cm [11]. 

2.3 Lymfeknutestatus 

Det har lenge vært kjent at den viktigste og tyngste prognostiske faktoren er patologisk lymfeknutestatus (pN). Metastaser til regionale lymfeknuter (= pN-positiv) utløser alltid adjuvant systemisk behandling. Det er en sterk sammenheng mellom antall lymfeknuter med metastase og overlevelse [12]. Fem års overlevelse i et eldre materiale for pasienter uten påviste metastaser til axillære lymfeknuter (pN-negative) var 82,8% , pN1-3= 73%, pN4-12=45,7% og for pN≥13 var den 28,4% [13]. Siden pN er så tung prognostisk faktor, er det hos pN-negative pasienter viktig å etablere robuste prognostiske og prediktive faktorer for å kunne unngå over- og underbehandling. Kirurgisk håndtering av axillen har de siste årene blitt endret vesentlig og denne presenteres i en egen artikkel i dette nummeret. 

2.4. Histologisk differensieringsgrad

Bloom-Richardsons histologiske graderingssystem [14] er viktig for å si noe om prognosen av brystkreft. Svulstene graderes i tre; Grad 1,2 og 3, der sistnevnte er dårligst differensiert. I graderingen inngår tre elementer; tubulær formasjon, kjerneatypi og proliferasjon vurdert som antall mitoser i 10 synsfelt [15]. Følgelig ligger det muligheter for individuelle variasjoner i hvor sterk atypien bedømmes og hvor i preparatet mitosene er talt. Dette fører til en varierende og til tider dårlig reproduserbarhet av denne faktoren. Histologisk grad er sterk prognostisk [15] og en viktig faktor for vurdering av adjuvant systemisk behandling for svulster under 2 cm (pT1 svulster). Grad 1 svulster slipper ofte unna kjemoterapi, mens grad 3 utløser vanligvis en slik systemisk behandling. Multivariabelanalyse demonstrerer imidlertid at det kun er proliferasjon (mitosetallet) i graden som har prognostisk egenskap mens tubulær formasjon og kjerneatypi faller ut av modellen [16]. Histologisk grad 1 og 3 er mest reproduserbare, mens Grad 2 er vanskeligere. Gradering ved hjelp av genekspresjonsanalyser (Genomisk Grad) har kunnet vise at Grad 2 svulstene er en blanding av Grad 1 og Grad 3 tumores. De genene som betyr mest for denne klassifikasjonen er proliferasjons- og cellesyklus gener [17]. Dette samsvarer med de observasjoner vedr. histologisk grad og mitosetall nevnt over. I de siste årene har NBCG tatt høyde for proliferasjon som egen selvstendig faktor, som gjør at svulster med lav grad og samtidig høy proliferasjon likevel får systemisk behandling (Se Ki-67).

2.5 Østrogen- og Progesteronreseptor

Østrogenreseptor (ER) og Progesteronreseptor (PR) er de viktigste biomarkørene for effekt av endokrin behandling i brystkreft. Begge tilhører gruppen kjernereseptorer. ER har responselementer i promoter regionen til om lag 1000 ulike gener som griper inn i flere ”Hallmarks of Cancer”, bla proliferasjon, overlevelsesmekanismer og vekst av kreftcellene. Derfor er hemming av denne signalveien et potent anticancer mål. ER detekteres i dag immunhistokjemisk (IHC) på parafinsnitt (Figur 4A). ER utrykk angis enten i % positive celler eller som en samlet vurdering av prosent og intensitet (H-score eller Allred score). Det er en sammenheng mellom mengden uttrykk ER og respons på antiøstrogen behandling, men det er samme effekt av både tamoxifen og Aromatasehemmere (AI) uansett for alle nivåer av ER. Det er altså ingen nivå av ER som predikerer bedre effekt av AI vs. tamoxifen eller omvendt [18, 19]. Grad av ER positivitet (ER+) er bestemmende for når endokrin behandling kan gis alene eller når en må supplere med kjemoterapi. Jo høyere ER innhold, i jo høyere grad er tumoren avhengig av endokrine signalveier. Man kan lettere oppnå systemisk kontroll med antiøstrogener uten annen tilleggsbehandling. Men ER må sees i forhold til de andre faktorene når slike terapivalg gjøres. 

ER stimulerer til produksjon av Progesteron reseptor (PR) (Figur 4B) som igjen til stimulerer proteinsyntese og vekst av cellene. PR blir derfor brukt som et orienterende mål på grad av endokrinfølsomhet. Tilstedeværelsen av både ER og PR har demonstrert en høyere endokrin responsrate enn når PR ikke er tilstede. Endokrin respons på tamoxifen i sub-gruppene ER+/PR+ er 50-70 %, mens den reduseres til 30-40% dersom PR faller bort [6]. Fravær av PR er et utrykk for en begynnende endokrin resistens. Det vil si at kreftcellene har begynt å skifte over til andre signalveier som stimulerer proteinsyntese og vekst av cellene gjennom membranbundne reseptorer. Disse signalveiene kan ikke hemmes med medikamenter som hemmer ER signal (Figur 7). Endokrin resistens fanges bedre opp med tilstedeværelse av membranreseptoren HER-2 eller økt proliferasjonsaktivitet utrykt ved Ki-67 (se under). Dette gjenspeiles i at selv i ER+/PR+ gruppen er
det noen som ikke reagerer på endokrin behandling. De nye molekylærbiologiske metodene kan definere subgrupper av ER positive svulster etter andre kriterier som gir viktig prognostisk og prediktiv informasjon for effekt av kjemoterapi (se under). 

 

2.6 Human Epitelial vekstfaktor Reseptor-2 

Human Epitelial Vekstfaktor Reseptor type 2 (HER-2) er en transmembran reseptor med et ekstracellulært domene og en intracellulær tyrosin kinase enhet som kan aktivere nedadgående signalveier gjennom ras-Raf-Mek-Erk kaskaden og med krysskobling til Akt/m-TOR veien. Rundt 15-20 % av kvinner med brystkreft har uttrykt overekspresjon av HER-2 på gennivå og/eller på proteinnivå. Deteksjon av HER -2 i vev skjer ved hjelp av immunhistokjemi (Fig 4C) eller ved hjelp av in situ hybridiseringer (FISH/CISH) som påviser amplifikasjonsgraden av selve genet. Ved amplifikasjon er der 10-100 ganger flere HER-2 molekyler pr. mammaeptielcelle enn normalt. Derved forsterkes signaloverføringen med økt proliferasjon, vekst og overlevelse som resultat. HER-2 korrelerer med Ki-67, Grad, pT og pN. Imidlertid er HER- 2 også en uavhengig prognostisk og prediktiv faktor mtp. effekt av kjemoterapi (Tabell 3) med monoklonale antistoffer som trastuzumab (Herceptin™) [20] og lapatinib (Tyverb™) (Figur 7). 

2.7 Ki-67 – en måte å estimere proliferasjon på

Øket celledeling skaper nye generasjoner kreftceller med muligheter for stadig nye mutasjoner (opptil flere hundre) og mer aggressive cellekloner. Dette belyser proliferasjonens prognostiske tyngde. Kjemoterapi virker kraftigst i celler som går inn og ut av mitose og kan forklare dens generelle prediktive verdi for cytostatika. Cellesyklus aktiverer mange styringsproteiner og et av disse er Ki-67. Proteinet er tilstede i alle faser av cellesyklus (G1-, S-, G2- og M-fasene). Det ble oppdaget i 1983 i byen Kiel hvor antistoffklonen i brønn nr. 67 i et forsøksoppsett (derfor kalt Ki-67) reagerte mot et protein i en myelomcellekultur som korrelerte sterkt med proliferasjon [21]. I dag brukes som regel MIB-1 klonen i immunhistokjemisk deteksjon av Ki-67 (Figur 4D). Det foreligge ingen internasjonal konsensus om hvordan Ki-67 nivået i svulstene skal rapporteres. Dette har ført til ulike protokoller og ulike terskelverdier som skiller mellom ”lav Ki-67” og ”høy Ki-67”. Noe av årsaken til at studier av Ki-67 på brystkreft har vist sprikende resultater ligger trolig her [22]. I tillegg vil de mange ”ufarlige” celler som ikke overlever cellesyklus (apoptose) bli farget og talt med. Patologimiljøet i Norge har derfor forsøkt å standardisere Ki-67 målingene i en egen protokoll i NBCG som har 15% og 30% som grense i forhold til iverksetting av ulike typer adjuvant behandling [7]. 

Til tross for at det foreligger en sterk korrelasjon mellom Ki-67 og andre prognostiske faktorer ( histologisk grad, ER- og HER2 status), har Ki-67 en uavhengig prognostisk egenskap[23]. Meta-analyser av ubehandlede pasienter har vist at Ki-67 predikerer totaloverlevelse og sykdomsfri overlevelse for hele populasjonen og for både pN-negative og pN-positive pasienter [22]. Ki-67 kan også brukes som en surrogatmarkør for å skille mellom Luminal A og B svulster (se pkt. 3). Høy proliferasjon målt med Ki-67 har predikert effekt av kjemoterapi hos pN-negative pasienter som fikk tamoxifen [24]. Videre bedres prognosen ved høy-proliferative svulster hos både pN-negative og pN- positive dersom man legger til taxaner [25]. Høy Ki-67 predikerer også bedre resultat med adjuvant endokrin behandling dersom aromatasehemmeren letrozole blir gitt først sammenlignet med up-front tamoxifen [26]. Likeledes supplerer Ki-67 prognostisk informasjon hos pN-negative pasienter med Grad 2 og til ER+ cancere og skiller hver av disse gruppene i to klare undergrupper [27].  

Betydningen av proliferasjonsmål hos ubehandlete pN-negative pasienter målt som Mitotisk Aktivitets Index (MAI) ble også bekreftet i en analyse av 516 pN-negative pasienter. MAI kunne tilføre selvstendig prognostisk informasjon til klassiske prognostiske faktorer [28]. 

3. De nye molekylærbiologiske testene

I kjølvannet av det humane genomprosjekt er det utviklet genekspresjonsanalyser vha. micro-array teknikker for å kartlegge den molekylære fenotype, dvs. mRNA utrykket av de ulike 25-30 000 genene som finnes i det humane genom. Selv om disse metodene ikke er i klinisk bruk i Norge i dag, er det en fordel å kjenne til muligheter og begrensninger disse metodene har. Genekspresjonsanalyser finnes i tre ulike kategorier. Den ene er ”unsupervised hieriarkalske cluster analyser”, som er en eksplorativ tilnærming hvor en i et utvalg av gener grupperer pasienter med samme genprofil og ser på biologiske egenskaper. Eksempel på denne er Therese Sørlie og medarbeideres definisjon av en ”intrinsic genprofil” ved hjelp av 456 gener[5]. Dette førte til et paradigeskifte med en helt ny taxonomi for brystkreftsvulster (Figur 5A). Minst fem undergrupper ble definert og senere har flere blitt lagt til. Svulster med lignende genprofil som de luminale kjertelcellene i brystet har alle østrogenreseptor oppregulert og kunne deles i to undergrupper; Luminal A og B. Luminal B klassen har i tillegg til oppregulert ER reseptor økt proliferajonsgener og skiller seg prognostisk fra Luminal A klassen (Figur 5B). HER-2 gruppen har HER-2 reseptor som dominerende gen, mens basal typen har gener som basalceller (myoepiteliale celler) i kjertelenheten. Denne utrykker bla. proliferasjonsgener, CK5 og human epitelial vekstfaktor reseptor type 1 (HER-1=EGFR). Et immunhistokjemisk korrelat til denne taxonomien bekrefter de prognostiske egenskaper for de korresponderende proteiner til de mest sentrale gener. Således korresponderer Luminal A med ER+/HER-2 negativ /lav Ki-67, mens Luminal B kan beskrives med ER+/HER-2 negativ / høy Ki-67 eller ER+/HER-2+/ alle verdier av Ki-67. Denne immungrupperingen var sterkt prognostisk i pN-negative svulster og er en god tilnærming for den klinisk relevante tumorbiologiske informasjon som genetisk subtyping gir oss [29]. 

Den andre metoden er ”supervised analyse” som analyserer genuttrykk inn mot et klinisk relevant og kjent endepunkt, f.eks. metatasefri overlevelse. Da vil man kunne se på forskjeller i genuttrykk mellom de som fikk systemisk residiv og de som fortsatt er friske på analysetidspunktet. Rasjonale for denne bruken ligger i hypotesen om at det naturlige forløpet av en tumor er bestemt av dens underliggende signalgivende regulator gener [30]. Dette er gjort med Amsterdam genprofilen (Mammaprint™) som vha. 70 utrykte gener grupperer pasienter i to prognostiske grupper med ”good signature ” og ”poor signature ” [31]. De gener som separerte gruppene best var proliferasjonsrelaterte gener, ER og HER-2. Det viser at ”supervised analyser” biter seg selv litt i halen fordi de med genekspresjon egentlig bare viser det vi har visst i mange år; at det er disse tre elementene som er de tyngste prognostikatorene i brystkreft. 

”Kandidat-gen” metoden er en tredje tilnærming der man selekterer ut bare noen få biologisk relevante gener som kan beskrive tumors fenotype prognostisk og predikere terapirespons. En av disse er Oncotype DX™ som har 21 gener (16 tumorgener + 5 kontrollgener) mens andre kan ha så få som 2 gener (Theros™) (Figur 6). Oncotype DX ™ beregner Recurrence Score (RS) som er et kontinuerlig 10-års risiko estimat med en lineær sammenheng til systemisk tilbakefall. Recurrence scoren kan igjen deles inn i tre kategorier; lav (<18), middels (18-30) og høy (≥31) med hhv. 7%, 15% og 31% sannsynlighet for systemisk tilbakefall i løpet av 10 år [18]. Recurrence Score er både prognostisk og prediktiv for effekt av kjemoterapi i pT1/pN-negative/ER+ svulster som får tamoxifen[24] og for de som får tillegg av taxaner hos pN-positive med Luminal B immunprofil[32]. Høy RS-score i pT1/pN0/ER+/Her-2 negativ svulster utløser altså anbefaling av kjemoterapi slik som Ki-67 gjør i NBCG algoritmen. De genene med høyest vekt i beregningen av RS-scoren er Ki-67, HER-2 og ER og det vil følgelig være et stort overlapp mellom Oncotype DX ™og kombinasjonen av disse tre faktorene[33]. Tabell 2 viser noen sentrale forskjeller mellom klassiske biomarkører og genekspresjonsanalysene.  

Ved vekting av de ulike gener for Mammaprint™, Oncotype DX™ og Genomisk Grad finner en at proliferasjonsgener veier tyngst, deretter kommer ER og HER-2 [33]. På sett og vis har vi kommet ”hjem igjen” til de biomarkørene vi har brukt i mange år. Det er betryggende at de nye metodene har kunnet konfirmere at disse faktorene er biologisk robuste markører, ikke minst proliferasjon som selvstendig prediktiv faktor. Kan vi ikke da klare oss med de klassiske faktorene vi allerede har? Dersom vi kan holde høy kvalitet på analysene av de gamle faktorene vil vi kunne forsvare å fortsette og benytte disse i klinikken [33]. Men de molekylærbiologiske markørene har flere fordeler sammenlignet med de etablerte faktorene. De benytter flere gener som kan fange opp ulike sider ved tumorbiologien i forhold til det bare tre-fire biomarkører kan. Genekspresjonsanalysene er også godt reproduserbare med liten individuell variasjon siden de analyseres av en referanse lab med bruk av referansegener [34]. Derved nøytraliseres mye av variasjonen i den pre-analytiske håndteringen av preparatet. Det er ingen subjektive individuelle vurderinger, men maskinell avlesning av resultatet. Men genekspresjonsanalysene har en svakhet vedrørende heterogenitet i tumor dersom man baserer analysen på en sylinderbiopsi. Det anbefales derfor heltumor-analyser til klinisk bruk og sylinderbiopsier til forskning hvor mange hundre pasienter er inkludert [35]. 

4. Mot en mer individualisert behandling? 

En har f
ere muligheter til å uthente mer tumorbiologisk informasjon for å kunne optimalisere den individuelle behandling. Det ene er å kombinere eksisterende informasjon for å øke prognostisk styrke og gjøre grenseoppganger sikrere. Rasjonale med denne metoden er at der er en stor overlapp i den prognostiske informasjon mellom de ulike markører. Der en faktor ikke fanger opp tilstrekkelig informasjon om tumorens biologiske fenotype vil de andre faktorene overta. Hvis en faktor er feilvurdert kan de andre korrigere for en slik ukorrekt analyse. Men overlappingen mellom biomarkørene setter også grense for nytten av å legge til flere i en slik algoritme. Webkalkulatoren Adjuvant! Online [36] kombinerer også komorbiditet sammen med etablerte biomarkører for å estimere betydning av ulike terapi regimer for 10-års overlevelse estimat (Figur 6). Den baserer seg på terapi og overlevelsesdata fra SEER (Surveilance, Epidemiology and End Results) databasen i USA. Den er mye brukt i forskningssammenheng [28] og kan nok i noen tilfeller hjelpe klinikeren i vanskelige avgjørelser sammen med pasienten. Ulempen med Adjuvant! er at den er basert på amerikanske kvinner, og at separat informasjon om HER-2 og proliferasjon ikke er tilgjengelig pr. i dag (men kommer trolig i neste versjon).  

Fra onkologisk hold er der håp om at genekspresjonsanalyser kan gi ny biologisk informasjon av svulsten som igjen kan lede til utvikling av helt nye medikamenter. Eksplorative studier som kan avdekke signalveier eller prosesser som kan rammes på en innovativ måte er mulig [37]. Studier av PARP-hemmere hos trippel negative BRCA1-mutanter er et eksempel på dette. Helgenomsekvensering av hver enkelt svulst kan være en realitet om noen år. Dette gir klart en helt ny situasjon der også alternativ spleising av gener og epigenetiske forandringer kan inkluderes i den tumorbiologiske analyse [38]. Da kan man kartlegge forandringer i enkeltgener bedre for å avdekke mekanismer mtp. kjemoresistens på individnivå [37]. 

Introduksjon av flere biomarkører vil utvilsomt føre til lettere beslutninger i forhold til mange pasienter. Men de vil også skape flere grensesituasjoner. Vi kan derfor ikke fjerne behovet for å gi god informasjon til pasienten ved å øke antallet biomarkører. Pasientens medvirkning i beslutnings prosessen er viktig [39]. Som klinikere opplever vi et økende ønske fra pasienter om å få innsikt i grunnlaget for terapibeslutningen. Dette  krever integrert kunnskap i grenseoppgangene mellom kliniske spesialiteter og molekylærbiologi, noe som utvilsomt vil bli en viktig del av den fremtidige utdanningen av bryst og endokrin kirurger. 

Molekylærbiologiske metoder viser at våre klassiske faktorer fortsatt holder mål til klinisk bruk, men understreker viktigheten av standardisering og streng kvalitetskontroll. Det blir spennende og se om noen av disse nye testene kommer i klinisk bruk i Norge i årene som kommer